㈠ 有誰能詳細說一下全基因組Bisulfite Sequencing的流程
亞硫酸氫鈉測序法(bisulfite genomic sequencing)
直接測序法是建立在MSP基礎上進一步深入研究CpG島各個位點甲基化情況的方法。重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增(引物設計時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。最後，對PCR產物進行測序，並且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優點。測序法以CpG島兩側不含CpG點的一段序列為引物配對區，所以能夠同時擴增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據，需要大量的克隆及質粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。
第一部分 基因組DNA的提取。
這一步沒有懸念，完全可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取完全可以。DNA比較穩定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。
此步重點在於DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細節：
1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配製成20mg/ml；
2：RNA酶必須要配製成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶後進行再處理，配製成10mg/ml。否則可能的後果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均於-20度保存。
驗證提取DNA的純度的方法有二：
1：紫外分光光度計計算OD比值；
2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
我傾向於第二種方法，這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度，並根據Marker的上樣量估計其濃度，以用於下一步的修飾。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經高壓蒸汽滅菌。
1：將約2ugDNA於1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；
2：加5.5ul新鮮配製的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期間配製：
4：10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴後混合液中；（溶液變成淡黃色）
5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配製方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，並以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH後會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准確為5.0。加520ul至上述水浴後溶液中。
6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。
7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以後收，時間上很合適。
這一步細節：
1：基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以後純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。
2：所有試劑均須新鮮配製，所以配液的技術要過關，既要快，又要精確。
3：亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用鹼將PH調制5.0，否則PH不合適會影響後續純化吸收。
4：水浴最好達16小時，雖可以短至8小時，但後者修飾會有不完全。
第三部分 修飾後DNA純化回收
EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的。
1. 將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然後吸取混合液至一潔凈1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統（Promega，A7280）
1）70℃水浴預熱DDW；配製80%異丙醇；
2）加1ml Promega』s Wizard DNA Clean-up resin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結合；
3）由於該試劑盒中僅配備針筒沒有針栓，如果有真空負壓吸引器，使用起來很方便；如果沒有，需要自備3ml-5ml注射器。將注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接後，將上述混合物用移液器移至針筒內，用2ml以上的EP管放置小柱下接收廢液。加針栓，輕輕加壓，將液體擠出，此時可見小柱內有白色的樹脂沉積。
4）將注射器與小柱分離後拔出針栓，再將針筒與小柱連接，向針筒內加入2ml 80％的異丙醇，插入針栓，輕輕加壓，將異丙醇擠出。此為洗滌步驟。
5）將注射器與小柱分離，將小柱置於潔凈1.5ml潔凈EP管上，離心12000rpm，2min，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂乾燥。此時，修飾後DNA處於與樹脂結合狀態。
6）將小柱取下置於另一潔凈1.5mlEP管上，移液器加50ul預熱好的DDW，室溫放置5min。
7）離心12000rpm，20s，此為洗脫步驟，此時EP管內液體即為洗脫的修飾後DNA溶液，終體積為50ul。
3：加5.5ul 新鮮配製的3M NaOH，室溫放置15min。
4：加33ul 10M乙酸銨，以中和NaOH，使溶液PH於7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作為沉澱指示劑，因為其與乙醇混合後可產生沉澱，便於以後離心後辨別回收物的位置，以防在吸取殘余乙醇時將回收物吸走。其實，加入這些糖原究竟能起多大作用，不好說。不過有國產糖原賣，包裝不大，也很便宜，買來一用，算嚴格遵守文獻的步驟吧。
6：加270ul 冰無水乙醇，置於-20度，過夜沉澱。有人為沉澱最短可至2小時，但我認為時間長些可能會更好。並且做到此步驟時，一般會到中午，如果樣本多的話要到下午，不妨放置過夜，日程可以輕鬆些，順便做些其他試驗。如果想當天做完，沒有問題，但我認為最好多沉澱些時候，至少6小時吧（這是經驗，我做過最少6小時，也是可以的，再短就不敢發表意見了）
7：4度，12000rpm離心，30min，倒去上清液，收集沉澱。不必吸凈。
8：加500ul 70%乙醇，不要將沉澱吹打起來，只要把乙醇加上即可。輕柔傾斜EP管，旋轉一圈，再次離心，4度12000rpm，5min。離心後倒掉上清，再加同量乙醇，同樣再做一遍。此為洗滌步驟，共2次。
9：倒掉上清，並常溫簡短離心後，將附壁乙醇離至EP管底，移液器小心將殘余液體吸凈，室溫乾燥5min，或沉澱由不透明變為半透明或透明時，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉澱。至此，已完成了修飾後DNA的純化回收，所得為修飾後DNA溶液，可用於此後的進一步實驗。
10：-20℃保存DNA溶液。
此步細節：
1：在使用注射器時，一定要用力均勻且輕，如使用暴力，會將小柱內的薄膜擠破，失去作用。
2：乙酸銨、糖原不需新鮮配製，糖原配好後放在-20度保存，乙酸銨室溫即可，因為這樣濃度的乙酸銨非常難溶，一旦放在4度，取出用時也會有很多溶質析出。
3：異丙醇、70%乙醇都不需要新鮮配製，但如果用量大，現場配也很方便。
此步關鍵是在樹脂與DNA的結合上，這就再次強調第二部分調亞硫酸鈉PH值得重要性。因為樹脂與DNA結合需要有一個適當的PH，如前一步沒做好，此步樹脂不能與DNA很好結合，將會帶來災難性後果，即DNA隨著液體被擠出了，洗脫時實際已沒有任何DNA了。
第四部分 修飾後DNA用於PCR
這一步也沒有懸念。我主要談一下這裡面的幾個比較棘手的問題：
1：引物問題：我感覺自己設計引物有相當的難度，我曾設計過幾對引物，並且試驗了一下，但以失敗告終。如果時間充裕、作的又是比較新的基因文獻不多，自己設計引物沒有問題。如果不是這樣，還是參考文獻更好些。首先查閱SCI分值高的文獻，然後是著名實驗室的文獻，如果國內有做的，更好了，可以直接聯系咨詢。查到序列後，一定要和Genbank中的序列進行比對，防止有印刷錯誤造成的個別鹼基的差別。然後再到google上搜一下，看用的人多否，體系條件是否一樣。用的人多、體系條件一樣，表明可重復性比較強。我也是按此行事，算比較順利。
2：Taq酶問題：有文獻用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感覺只要體系正確、變性退火等條件合適，一般的熱啟動酶是可以的。我開始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA緩沖液。有時候用沒了，暫時以Takara 的普通Taq酶也可以。如何選擇，可以根據自己的情況。初作者還是用好一點的酶。
3：PCR的條件：變性一般都選擇95度，3min。其餘我感覺還是根據文獻，退火可以根據你的引物的退火溫度在小范圍內嘗試。一般和文獻報道差別不大。只是擴增片斷特異性的問題。建議根據文獻。
4：做PCR的EP管最好選擇進口的，壁薄且厚度均勻，這可以保證溫度的迅速變化可以及時傳遞給管內的反應液，使體系真正在所設定的溫度下運行。
5：PCR儀：如果在某一個儀器上作出來了，最好一直用此儀器繼續。不同的儀器「脾氣」也不一樣，但EP管必要和儀器內的插孔緊密結合方好，留有空隙，我認為會影響溫度的傳遞。
這一部分有些啰嗦，只是個人一些不成熟經驗。有疑問處，請大家指出，交流。今天先到這里，現寫一些內容，比較費勁，總是不能一揮而就。望見諒。歇息一會准備寫最後藍白斑篩選克隆這一部分。
第五部分 PCR產物的凝膠回收
這一步比較簡單，可以購買一個凝膠PCR產物回收試劑盒，國產的就很好、價格也合理，比如TIANGEN的產品（用過）。把切下來的膠按說明書操作即可。
幾個細節：
1：PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可。
2：凝膠DNA回收時在300nm紫外燈下觀察條帶位置，切取目的片斷所在位置的凝膠，盡量小，保證特異性。
3：紫外照射時間不能過長，否則對DNA有損傷。
4：回收後的DNA如不馬上用就儲存於-20度，在數月內是很穩定的。
第六部分 PCR產物與T載體的連接和轉化、藍白斑篩選
1：連接T載體（本實驗使用的是Promega的試劑盒）
15ul體系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，過夜。
2：連接產物的轉化
1）-70度冰箱內取出感受態細菌，融化後置於冰上；
2）連接產物15ul 全部加入，至於冰上30分鍾；
3）42度， 90秒鍾；
4）冰上2分鍾；
5）800ul LB培養基；
6）280rpm，37度，搖床45分鍾（將管放水平了搖，保證菌液搖勻）；
7）8000rpm，1分鍾；在超凈台內去上清，留100-150ul；
8）塗板：37度孵箱過夜；（板為含有氨苄青黴素的固體LB培養基）
先塗：X-gar 35ul
IPTG 25ul
後塗：混懸液
過夜後可見板上長出很多藍色或白色斑點，取白色斑點，尤其是藍色斑點周圍的白色斑點，此處自聯率較低。
3：取白斑，劃種於新板上
新板：先塗：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然後於板底劃出分區，進行標記。根據需要，一般一板作50個克隆沒有問題。
針頭挑白斑劃2道於板上相應區域內。
37度，孵箱過夜。
4：聯系測序公司送測序。一般一個克隆在35-45元。
這一部分的細節：
1：塗板要均勻，保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上；
2：不要讓藍白斑長得太滿，否則選取克隆時容易一下挑2個。